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Dosage par étalonnage : absorbance et loi de Beer-Lambert
Absorbance et spectre d’absorption UV-visible ; couleur d’une espèce en solution et couleurs complémentaires ; loi de Beer-Lambert ; réaliser une gamme étalon ; déterminer une concentration par étalonnage ; limites du protocole (domaine de validité, dilution préalable).
À propos de cette page
Absorbance, spectre d’absorption et couleur
En seconde, tu as dosé une espèce colorée en comparant sa teinte à une échelle de teintes (Solutions aqueuses). Le spectrophotomètre remplace l’œil par une mesure.
Absorbance. Un spectrophotomètre envoie à travers une cuve contenant la solution une lumière d’une seule longueur d’onde λ, choisie, et mesure l’absorbance A : une grandeur sans unité, positive, d’autant plus grande que la solution absorbe cette radiation. A = 0 : la radiation traverse la solution sans être absorbée.
Spectre d’absorption. En faisant varier λ, on obtient la courbe A = f(λ), le spectre d’absorption UV-visible de l’espèce (ultraviolet : λ < 400 nm ; visible : de 400 à 800 nm environ). Le sommet de la bande la plus haute donne la longueur d’onde λmax du maximum d’absorption.
Couleur d’une solution. Éclairée en lumière blanche, la solution absorbe certaines radiations et transmet les autres : on voit la lumière transmise. Si le spectre ne présente qu’une bande dans le visible, la solution a la couleur complémentaire de la couleur absorbée, diamétralement opposée sur le cercle chromatique : rouge ↔ cyan, vert ↔ magenta, bleu ↔ jaune. Une espèce qui n’absorbe que dans l’ultraviolet donne une solution incolore.
Les domaines de longueurs d’onde sont des repères approximatifs ; le rouge comprend ici l’orangé. Le magenta n’est pas une radiation du spectre : c’est un mélange de rouge et de bleu.
Une solution de tartrazine, colorant alimentaire E102 : son spectre présente une seule bande, de maximum vers 427 nm, dans le bleu. La solution absorbe le bleu et paraît jaune.
Un extrait de chlorophylle : deux bandes, vers 430 nm (bleu) et vers 662 nm (rouge), et presque aucune absorption entre 500 et 600 nm. Le bleu et le rouge sont retirés, le vert est transmis : l’extrait est vert.
Une solution d’ions cuivre(II) absorbe surtout le rouge, avec un maximum vers 800 nm, à la limite du visible : elle paraît bleue, de la couleur cyan complémentaire du rouge.
Réflexe — je lis λmax sur le spectre, je nomme la couleur absorbée, puis je prends la couleur opposée sur le cercle chromatique.
Attention — une solution bleue n’absorbe pas le bleu : elle le transmet, et absorbe la couleur complémentaire. La règle de la couleur complémentaire vaut pour une seule bande d’absorption ; avec deux bandes, on cherche ce qui reste transmis.
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La loi de Beer-Lambert
Pour une solution diluée d’une espèce colorée, à une longueur d’onde fixée et pour une cuve donnée, l’absorbance est proportionnelle à la concentration en quantité de matière de cette espèce :
A = k × C
A sans unité, C en mol·L⁻¹, k en L·mol⁻¹. Le coefficient k dépend de l’espèce, de la longueur d’onde et de l’épaisseur ℓ de la cuve traversée par la lumière.
Écriture détaillée : A = ε × ℓ × C, où ε est le coefficient d’absorption molaire de l’espèce à cette longueur d’onde (en L·mol⁻¹·cm⁻¹) et ℓ l’épaisseur de la cuve (en cm) : k = ε × ℓ. Une cuve deux fois plus épaisse donne une absorbance deux fois plus grande.
Conséquences : un étalon de concentration connue donne k = A ÷ C ; une solution diluée F fois a une absorbance divisée par F.
Conditions : solution diluée (en pratique, concentration inférieure à 10⁻² mol·L⁻¹ environ et absorbance de l’ordre de 1 au plus), limpide, éclairée par une seule radiation.
Un colorant rouge : un étalon à 5,00 × 10⁻⁵ mol·L⁻¹ donne A = 0,615 à λmax, dans une cuve de 1,00 cm. k = 0,615 ÷ (5,00 × 10⁻⁵) = 1,23 × 10⁴ L·mol⁻¹, et ε = k ÷ ℓ = 1,23 × 10⁴ L·mol⁻¹·cm⁻¹.
Une solution du même colorant a pour absorbance 0,492 : C = 0,492 ÷ (1,23 × 10⁴) = 4,00 × 10⁻⁵ mol·L⁻¹.
Cette solution diluée 4 fois : A = 0,492 ÷ 4 = 0,123. Sans dilution, dans une cuve de 2,00 cm : A = 2 × 0,492 = 0,984.
Réflexe — A et C sont proportionnelles : ce qui multiplie la concentration, ou l’épaisseur de la cuve, multiplie l’absorbance par le même nombre.
Attention — k ne vaut que pour cette espèce, à cette longueur d’onde et avec cette cuve. Et la proportionnalité ne vaut que pour une solution diluée.
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Réaliser une gamme étalon
Les dilutions se font avec la verrerie jaugée du chapitre Quantité de matière et concentrations : C₀ × V₀ = C₁ × V₁.
Solutions étalons : solutions de l’espèce à doser, de concentrations connues, préparées en général par dilution d’une même solution mère S₀ à la pipette jaugée et à la fiole jaugée : V₀ = V × C ÷ C₀. La gamme étalon encadre la concentration attendue.
Le protocole.
1. Tracer le spectre d’une solution de l’espèce et choisir λ = λmax : l’absorbance y est la plus grande, donc la mesure la plus sensible, et elle varie peu si la longueur d’onde est un peu décalée.
2. Régler le zéro (« faire le blanc ») avec une cuve remplie du solvant seul : on retire l’absorption due au solvant et à la cuve.
3. Mesurer l’absorbance de chaque étalon, du moins concentré au plus concentré, avec la même cuve et à la même longueur d’onde.
4. Tracer A = f(C). Si les points sont alignés sur une droite qui passe par l’origine (rapports A ÷ C constants), la loi de Beer-Lambert est vérifiée : k est le coefficient directeur de la droite.
Gamme d’un colorant violet, à partir d’une solution mère à C₀ = 4,00 × 10⁻⁴ mol·L⁻¹, dans des fioles jaugées de 50,0 mL, mesures à λmax = 545 nm :
| Étalon | V₀ prélevé (mL) | C (10⁻⁴ mol·L⁻¹) | A |
|---|---|---|---|
| 1 | 5,00 | 0,400 | 0,120 |
| 2 | 10,0 | 0,800 | 0,241 |
| 3 | 20,0 | 1,60 | 0,479 |
| 4 | 25,0 | 2,00 | 0,600 |
Pour l’étalon 3 : C = 4,00 × 10⁻⁴ × 20,0 ÷ 50,0 = 1,60 × 10⁻⁴ mol·L⁻¹.
Rapports A ÷ C : 3,00 × 10³ ; 3,01 × 10³ ; 2,99 × 10³ ; 3,00 × 10³ L·mol⁻¹. Ils sont constants, aux erreurs de mesure près : la loi de Beer-Lambert est vérifiée, avec k = 3,00 × 10³ L·mol⁻¹.
Réflexe — étalons par dilution d’une même solution mère ; blanc avec le solvant ; même cuve et même λmax pour toutes les mesures.
Attention — le blanc se fait avec le solvant, pas avec une cuve vide. Et on ne change ni de cuve ni de longueur d’onde en cours de série : k en dépend.
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Déterminer une concentration par étalonnage
On mesure l’absorbance A de la solution à doser dans les mêmes conditions que les étalons : même longueur d’onde, même cuve, même blanc.
1. Vérifier que A est comprise dans le domaine des étalons, entre la plus petite et la plus grande absorbance mesurées.
2. Lire ou calculer C. Graphiquement : on part de A sur l’axe vertical, on rejoint la droite, puis on descend sur l’axe des concentrations. Par le calcul : C = A ÷ k, plus précis.
3. Remonter à la solution étudiée : si elle a été diluée F fois avant la mesure, sa concentration vaut F × C.
4. En déduire si besoin une quantité de matière n = C × V, une masse m = n × M ou une concentration en masse Cm = C × M.
Avec la gamme du colorant violet (k = 3,00 × 10³ L·mol⁻¹), un échantillon donne A = 0,345, comprise entre 0,120 et 0,600 : la mesure est exploitable.
Par le calcul : C = 0,345 ÷ (3,00 × 10³) = 1,15 × 10⁻⁴ mol·L⁻¹, ce que confirme la lecture graphique.
L’échantillon provenait d’une solution S diluée 10 fois : CS = 10 × 1,15 × 10⁻⁴ = 1,15 × 10⁻³ mol·L⁻¹. Avec M = 496 g·mol⁻¹ : Cm = 1,15 × 10⁻³ × 496 ≈ 0,570 g·L⁻¹.
Réflexe — domaine des étalons d’abord, puis C = A ÷ k, puis × F si l’échantillon a été dilué.
Attention — oublier le facteur de dilution donne la concentration de la solution diluée, pas celle de la solution étudiée.
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Limites du protocole : domaine de validité et dilution
Domaine de validité. Aux fortes concentrations, l’absorbance n’est plus proportionnelle à la concentration : la courbe A = f(C) s’infléchit et A augmente moins vite que C, en pratique au-delà d’une absorbance de l’ordre de 1. On n’exploite donc une mesure que dans le domaine des étalons et on ne prolonge jamais la droite.
Échantillon trop concentré : on le dilue d’un facteur F connu (pipette jaugée et fiole jaugée), on mesure, on calcule C = A ÷ k, puis on multiplie par F.
Absorbance trop faible (quelques centièmes) : la mesure est peu précise ; on dilue moins ou on prend une cuve plus épaisse.
Autres limites. Une espèce incolore n’absorbe pas dans le visible : on peut parfois la transformer entièrement en une espèce colorée, comme les ions fer(II) en un complexe rouge-orangé. Si plusieurs espèces absorbent à la longueur d’onde choisie, la mesure n’est pas propre à l’espèce dosée. Une solution trouble diffuse la lumière et fausse A. Un blanc mal fait décale toutes les absorbances.
Une solution trop concentrée. Les étalons vont de 1,00 à 6,00 × 10⁻⁵ mol·L⁻¹, avec des absorbances de 0,120 à 0,720 (k = 1,20 × 10⁴ L·mol⁻¹). L’échantillon donne A = 1,32 : hors du domaine.
On le dilue 4 fois (25,0 mL complétés à 100,0 mL dans une fiole jaugée) : A′ = 0,402, dans le domaine. C′ = 0,402 ÷ (1,20 × 10⁴) = 3,35 × 10⁻⁵ mol·L⁻¹, donc C = 4 × 3,35 × 10⁻⁵ = 1,34 × 10⁻⁴ mol·L⁻¹.
Le calcul direct 1,32 ÷ (1,20 × 10⁴) = 1,10 × 10⁻⁴ mol·L⁻¹ aurait donné une valeur environ 18 % trop petite : la courbe réelle passe sous la droite prolongée.
Réflexe — hors du domaine des étalons, je dilue d’un facteur connu, je mesure de nouveau, puis je multiplie par F.
Attention — une absorbance hors domaine ne se corrige pas par le calcul : diviser par F une absorbance mal mesurée, sans diluer réellement, ne sert à rien.
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Pour aller plus loin
Ce que mesure l’absorbance. Elle compare l’intensité lumineuse I₀ qui entre dans la cuve à l’intensité I qui en sort : A = log(I₀ ÷ I). Pour A = 1, la solution ne laisse passer que 10 % de la lumière ; pour A = 2, 1 % seulement : les grandes absorbances sont donc mal mesurées.
Couleur des objets, synthèses additive et soustractive : Lumière : images, couleurs et photons.
Doser grâce à une réaction. Un titrage fait réagir l’espèce dosée avec un réactif de concentration connue, versé jusqu’à l’équivalence : l’espèce est consommée. Le dosage par étalonnage, lui, ne la consomme pas : Titrage : déterminer une quantité de matière.
En terminale, on étalonnera aussi avec la conductivité d’une solution ionique incolore (loi de Kohlrausch).
- Absorbance A : sans unité, mesurée à une longueur d’onde choisie ; spectre d’absorption A = f(λ), maximum à λmax.
- Une solution qui absorbe dans une seule bande a la couleur complémentaire de la couleur absorbée : rouge ↔ cyan, vert ↔ magenta, bleu ↔ jaune.
- Loi de Beer-Lambert, pour une solution diluée : A = k × C, k en L·mol⁻¹, qui dépend de l’espèce, de λ et de la cuve (k = ε × ℓ).
- Gamme étalon : dilutions d’une solution mère, blanc avec le solvant, mesures à λmax avec la même cuve ; droite passant par l’origine, de coefficient directeur k.
- Dosage : A dans le domaine des étalons, C = A ÷ k, puis × F si l’échantillon a été dilué ; sinon, diluer d’abord.
Questions fréquentes
Pourquoi une solution a-t-elle une couleur ?
Elle absorbe une partie de la lumière blanche et l’œil reçoit le reste. Si elle n’a qu’une bande d’absorption, elle a la couleur complémentaire de la couleur absorbée : une solution qui absorbe le bleu paraît jaune, une solution qui absorbe le rouge-orangé paraît bleue (cyan).
Que dit la loi de Beer-Lambert ?
Pour une solution diluée d’une espèce colorée, à longueur d’onde et cuve fixées, l’absorbance est proportionnelle à la concentration : A = k × C, avec k en L·mol⁻¹. On l’écrit aussi A = ε × ℓ × C, où ℓ est l’épaisseur de la cuve.
Comment réaliser une gamme étalon ?
On dilue une solution mère de concentration connue, à la pipette jaugée et à la fiole jaugée, pour obtenir plusieurs étalons. On fait le blanc avec le solvant, puis on mesure leur absorbance à λmax, toujours avec la même cuve.
Comment trouver une concentration avec une courbe d’étalonnage ?
On mesure l’absorbance de la solution, on vérifie qu’elle est dans le domaine des étalons, puis on lit C sur la droite ou on calcule C = A ÷ k. Si la solution avait été diluée F fois, on multiplie le résultat par F.
Que faire si l’absorbance est trop grande ?
Au-delà du domaine des étalons, en pratique vers A ≈ 1, l’absorbance n’est plus proportionnelle à la concentration : on ne prolonge pas la droite. On dilue la solution d’un facteur connu, on mesure de nouveau et on multiplie la concentration trouvée par ce facteur.
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