Les enzymes, des biomolécules aux propriétés catalytiques

a) Le substrat est la molécule transformée : l'urée (l'eau participe aussi à la réaction, qui est une hydrolyse). Les produits sont le dioxyde de carbone et l'ammoniac. L'enzyme qui catalyse la réaction est l'uréase.

b) Une enzyme est un catalyseur : elle se lie au substrat le temps de la réaction puis est libérée intacte. Elle n'est ni consommée ni produite, donc elle ne figure pas dans le bilan ; on l'écrit au-dessus de la flèche. L'uréase n'est pas un réactif : on la retrouve inchangée à la fin.

c) Uréase + urée → complexe uréase-urée (fixation de l'urée dans le site actif) → uréase + CO₂ + NH₃ (hydrolyse puis libération des produits). Soit E + S → ES → E + P ; l'uréase libérée peut fixer une nouvelle molécule d'urée.

d) Le tube 2 ne diffère du tube 1 que par l'absence d'uréase : c'est le témoin. Sans enzyme, le pH ne varie pas : l'urée n'est pas hydrolysée de façon détectable pendant la durée de l'expérience. Le virage du tube 1 est donc dû à l'uréase. L'uréase catalyse l'hydrolyse de l'urée, réaction trop lente sans elle pour être observée.

a) Le tube 4 contient du saccharose sans enzyme. Son résultat négatif montre que le saccharose ne réagit pas avec la bandelette et ne s'hydrolyse pas spontanément en 20 min. Un résultat positif dans le tube 1 ne peut donc venir que de l'action de l'invertase.

b) Du glucose libre est détecté dans le tube 1 alors qu'il n'y en a pas dans le tube 4 : l'invertase a coupé la liaison entre le glucose et le fructose. Saccharose + eau → glucose + fructose, réaction catalysée par l'invertase.

c) Aucun glucose libre dans les tubes 2 et 3, bien que le maltose et l'amidon soient formés de glucose : l'invertase n'a hydrolysé ni l'un ni l'autre. L'invertase n'agit pas sur le maltose et l'amidon.

d) L'invertase n'agit que sur le saccharose : c'est sa spécificité de substrat. Son site actif a une forme et une répartition de charges complémentaires du saccharose seulement ; le maltose et l'amidon ne peuvent pas s'y fixer, donc aucun complexe enzyme-substrat ne se forme et aucune hydrolyse n'a lieu.

a) L'activité est maximale (100 %) à pH 2. Le pH optimal de la pepsine est d'environ 2.

b) Le pH de l'estomac correspond au pH optimal de la pepsine : elle y fonctionne à son activité maximale. La pepsine est adaptée au milieu très acide de l'estomac, où elle digère les protéines.

c) Le pH modifie les charges électriques des acides aminés, en particulier ceux du site actif et ceux qui maintiennent la structure 3D. La forme et les charges du site actif ne sont plus complémentaires du substrat : moins de complexes enzyme-substrat se forment, l'activité diminue, jusqu'à devenir nulle à pH 6.

d) L'activité est déjà nulle à pH 6 ; à pH 8, encore plus éloigné de l'optimum, elle reste nulle. Un pH aussi éloigné de l'optimum modifie profondément la structure de la pepsine et la dénature. Dans l'intestin grêle, la pepsine est inactive : d'autres enzymes, adaptées à ce pH, y poursuivent la digestion des protéines.

a) De 0 à 20 s, la concentration augmente de 13 µmol·L⁻¹ toutes les 10 s : c'est la partie rectiligne initiale. Vi(A) = (26 − 0) / (20 − 0) = 1,3 µmol·L⁻¹·s⁻¹.

b) Le calcul 59 / 60 donne une vitesse moyenne sur toute la première minute, qui inclut la phase où la réaction ralentit : de 30 à 45 s, on ne gagne que 14 µmol·L⁻¹ en 15 s, et de 45 à 60 s seulement 7 µmol·L⁻¹, car l'eau oxygénée s'épuise. Cette moyenne (0,98) est inférieure à la vraie vitesse initiale (1,3). La vitesse initiale se calcule uniquement sur la partie rectiligne du début.

c) Dans l'essai B, la partie rectiligne se limite aux 10 premières secondes : Vi(B) = 27 / 10 = 2,7 µmol·L⁻¹·s⁻¹. Rapport : 2,7 / 1,3 ≈ 2,1 ≈ 2. Quand la quantité d'enzyme double, Vi double : deux fois plus de sites actifs forment deux fois plus de complexes enzyme-substrat par seconde, le substrat étant abondant. Vi est proportionnelle à la quantité d'enzyme.

d) La quantité finale de dioxygène dépend de la quantité d'eau oxygénée de départ, identique dans les deux essais. L'enzyme accélère la réaction sans en changer le bilan : l'essai B atteint seulement plus vite (vers 45 s au lieu de 90 s) la même valeur de 61 µmol·L⁻¹. Le plateau traduit l'épuisement du substrat, pas l'arrêt de l'enzyme.

a) Vi augmente avec la concentration en arginine, d'abord vite puis de plus en plus lentement. Quand [arginine] est multipliée par 4 de 0,5 à 2 mmol·L⁻¹, Vi passe de 1,0 à 2,6 µmol·min⁻¹ ; quand elle est multipliée par 4 de 10 à 40 mmol·L⁻¹, Vi ne passe que de 4,3 à 5,0 µmol·min⁻¹. Vi tend vers un plateau voisin de 5 µmol·min⁻¹.

b) Aux faibles concentrations, la plupart des sites actifs sont libres. Plus il y a de molécules d'arginine, plus les rencontres avec l'enzyme sont fréquentes, plus il se forme de complexes enzyme-substrat par minute : Vi augmente avec [S].

c) Aux fortes concentrations, presque tous les sites actifs sont occupés en permanence : l'enzyme est saturée. Chaque molécule d'arginase travaille à son rythme maximal ; ajouter du substrat ne crée plus de complexes supplémentaires. Vi plafonne à la vitesse maximale permise par la quantité d'enzyme.

d) La vitesse maximale dépend du nombre de sites actifs disponibles. Avec deux fois plus d'arginase, deux fois plus de complexes peuvent se former en même temps à saturation : Vi maximale ≈ 2 × 5 = 10 µmol·min⁻¹.

a) La glucose oxydase ne transforme que le glucose : aucun produit n'apparaît avec le fructose ni avec le galactose, qui ont pourtant la même formule brute, et même avec le galactose qui ne diffère du glucose que par l'orientation d'un seul –OH. Seul le glucose a une forme complémentaire de son site actif et peut former un complexe enzyme-substrat. La glucose oxydase a une spécificité de substrat stricte.

b) Avec le même substrat, le glucose, la glucose oxydase catalyse une oxydation (gluconolactone + eau oxygénée) tandis que l'hexokinase catalyse l'ajout d'un groupement phosphate (glucose-6-phosphate). Le type de réaction dépend donc de l'enzyme, et plus précisément de ses acides aminés catalytiques. C'est la spécificité d'action : même substrat, réactions différentes.

c) L'hexokinase agit sur le glucose et le fructose, mais pas sur le galactose. Son site actif reconnaît une partie de forme voisine commune au glucose et au fructose ; une simple différence d'orientation d'un –OH suffit à exclure le galactose. La spécificité de substrat n'impose pas un seul substrat, mais une famille restreinte de molécules complémentaires du site actif. De plus, la réaction reste la même (phosphorylation) : la spécificité de substrat est plus large mais réelle, et la spécificité d'action est conservée.

a) Le tube E (sans amylase) montre que l'amidon ne disparaît pas spontanément en 60 min : sa disparition dans les autres tubes est due à l'amylase. Le tube D (amylase non prétraitée, testée à 37 °C) donne la référence de l'activité normale : 7 min. E est le témoin sans enzyme, D le témoin d'activité.

b) Même prétraitement à 4 °C : testée à 4 °C (A), l'amylase n'a pas hydrolysé l'amidon en 60 min ; testée à 37 °C (B), elle l'hydrolyse en 7 min, comme D. L'enzyme refroidie retrouve toute son activité une fois réchauffée. Le froid ralentit fortement l'amylase, de façon réversible.

c) Testées à la même température, l'amylase chauffée à 85 °C (C) n'hydrolyse pas l'amidon en 60 min, alors que D le fait en 7 min. L'activité n'est pas retrouvée au retour à 37 °C. La forte chaleur inactive l'amylase de façon irréversible : elle est dénaturée.

d) À basse température, l'agitation des molécules est faible : les rencontres entre l'amylase et l'amidon sont rares, peu de complexes enzyme-substrat se forment, mais la structure 3D reste intacte. À 85 °C, les liaisons faibles qui maintiennent le repliement se rompent : la protéine se déplie, le site actif perd sa forme et ne la retrouve pas au refroidissement. Froid : structure conservée ; chaleur : structure détruite.

1. L'allèle a1 réduit l'activité à 0,8 % : l'enzyme est quasiment inactive. L'allèle a2 la réduit à 23 % : l'enzyme garde une activité notable. Pour a1, l'acide aminé remplacé appartient au site actif : la forme ou les charges du site actif sont modifiées, la phénylalanine ne s'y fixe plus correctement ou n'est plus transformée. Pour a2, le site actif est intact, mais la structure 3D est moins stable : une partie des molécules d'enzyme perd sa forme plus facilement, il reste donc moins d'enzymes fonctionnelles. a1 abolit presque l'activité, a2 la réduit d'environ trois quarts.

2. L'individu (N//a1) a une phénylalaninémie de 81 µmol·L⁻¹, inférieure à 120 : il a le phénotype habituel, comme (N//N). L'allèle N s'exprime dans le phénotype de l'hétérozygote, pas a1. L'allèle N produit une enzyme fonctionnelle : l'activité totale, environ (100 + 0,8) / 2 ≈ 50 %, suffit à transformer la phénylalanine. L'allèle a1 est récessif, N est dominant.

3. En supposant que chaque allèle contribue pour moitié, l'activité vaut environ 23 % chez (a2//a2), (0,8 + 23) / 2 ≈ 12 % chez (a1//a2) et 0,8 % chez (a1//a1). La phénylalaninémie vaut respectivement 390, 640 et 1 450 µmol·L⁻¹. Plus l'activité de la PAH est faible, moins la phénylalanine est transformée et plus elle s'accumule. Seul (a1//a1) dépasse 1 200 µmol·L⁻¹ : phénylcétonurie sévère ; les deux autres ont une élévation plus modérée. La gradation des phénotypes suit la gradation de l'activité enzymatique.

4. Échelle moléculaire : chez (a1//a1), un acide aminé du site actif est remplacé ; le site actif change de forme, le complexe PAH-phénylalanine ne se forme plus correctement, la phénylalanine n'est pas transformée en tyrosine. Échelle cellulaire : les cellules du foie ne dégradent plus la phénylalanine, qui passe dans le sang. Échelle de l'organisme : la phénylalaninémie atteint 1 450 µmol·L⁻¹, au-delà du seuil toxique de 1 200 : le développement du cerveau est perturbé, d'où le retard intellectuel. Un seul acide aminé modifié suffit à changer le phénotype à toutes les échelles.

5. La phénylalanine provient de l'alimentation. Un régime pauvre en phénylalanine réduit l'apport de substrat : même si l'enzyme est presque inactive, la phénylalanine ne s'accumule plus jusqu'au seuil toxique, et le cerveau se développe normalement. Le génotype n'a pas changé, mais le phénotype est modifié par l'environnement. Le régime agit sur la quantité de substrat, pas sur l'enzyme.

1. L'amylase de porc a son optimum vers 40 °C (92 % parmi les valeurs mesurées) ; elle est active de 20 à 70 °C environ et totalement inactive à partir de 80 °C. L'amylase bactérienne a son optimum vers 90 °C (100 %) ; elle reste active sur tout l'intervalle, avec encore 54 % à 100 °C, et elle est peu active aux basses températures (12 % à 20 °C). L'optimum de l'enzyme bactérienne est environ 50 °C plus élevé et son domaine d'activité est décalé vers les hautes températures.

2. À 20 °C, l'activité est faible parce que l'agitation des molécules est faible : les rencontres entre l'enzyme et l'amidon sont rares, mais la structure de l'enzyme est intacte. L'effet est réversible : l'enzyme réchauffée à 40 °C retrouve une forte activité. La dénaturation est provoquée par la forte chaleur, pas par le froid. À 20 °C, l'amylase est ralentie, pas dénaturée.

3. Au-delà de l'optimum, l'agitation thermique rompt les liaisons faibles qui maintiennent la structure 3D de l'amylase de porc. La protéine se déplie, le site actif se déforme et n'est plus complémentaire de l'amidon : de moins en moins de complexes enzyme-substrat se forment. L'activité passe de 92 % à 22 % à 60 °C, 5 % à 70 °C, puis 0 % à 80 °C. L'enzyme est progressivement, puis totalement dénaturée.

4. L'amylase bactérienne possède davantage de liaisons faibles maintenant son repliement. Il faut donc une agitation thermique plus forte, c'est-à-dire une température plus élevée, pour les rompre toutes : sa structure 3D, et la forme de son site actif, se conservent jusque vers 90 °C. À 100 °C, une partie des molécules commence à être dénaturée (54 %). Plus de liaisons stabilisant la structure → enzyme plus résistante à la chaleur.

5. Le procédé impose une activité à 95 °C. L'amylase de porc est inactive dès 80 °C (0 %) : elle serait dénaturée et ne couperait pas l'amidon. L'amylase bactérienne a 100 % d'activité à 90 °C et 54 % à 100 °C : à 95 °C, son activité reste élevée. Elle évite en outre de refroidir le mélange avant d'ajouter l'enzyme. Seule l'amylase bactérienne reste active à la température de liquéfaction.

1. La chaîne de 260 acides aminés ne reste pas linéaire : elle se replie en une structure tridimensionnelle déterminée par sa séquence. Ce repliement rapproche dans l'espace des acides aminés très éloignés dans la séquence (jusqu'à 122 positions d'écart entre 42 et 164), qui bordent alors une même poche. Le site actif est une structure 3D, pas un segment continu de la chaîne.

2. M1 (Trp 42 remplacé) ne fixe presque plus le substrat (6 %) et son activité s'effondre (4 %). M2 (Glu 87 remplacé) fixe normalement le substrat (97 %) mais ne le transforme plus du tout (0 %). Le tryptophane 42 intervient donc dans la fixation : c'est un acide aminé de fixation. L'acide glutamique 87 n'est pas nécessaire à la fixation mais indispensable à la transformation ; sa charge, absente chez la glutamine, joue un rôle dans la réaction : c'est un acide aminé catalytique.

3. Nécessaire : chez M1 et M4, le substrat ne se fixe plus (6 % et 3 %) et l'activité disparaît presque (4 % et 2 %) ; sans complexe enzyme-substrat, pas de catalyse. Non suffisante : chez M2, le complexe se forme (97 % de fixation) mais aucun produit n'apparaît (0 %). La catalyse exige à la fois la fixation du substrat et l'action des acides aminés catalytiques.

4. M3 porte une substitution en surface, loin du site actif, et l'arginine a une taille et une charge voisines de celles de la lysine. Le repliement et le site actif ne sont pas modifiés : fixation (99 %) et activité (98 %) sont conservées. Une mutation ne modifie pas forcément l'activité d'une enzyme.

5. La proline introduite au cœur de la protéine rigidifie la chaîne et perturbe son repliement. La structure 3D est modifiée à distance, jusqu'au site actif dont la poche est déformée : le substrat ne s'y fixe plus (3 %) et l'activité chute à 2 %. Un acide aminé extérieur au site actif peut conditionner l'activité en commandant la forme d'ensemble de l'enzyme : séquence → structure → fonction.